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PCR

Découverte en 1986 par Kary Mullis (prix Nobel de chimie en 1993), la PCR ou Polymerase Chain Reaction est une méthode de détection directe du génome des agents infectieux ou parasitaires par amplification enzymatique d’une partie de celui-ci. Cet outil de biologie moléculaire est très spécifique et permet de détecter de façon reproductible de très faibles quantités d’agents pathogènes dans des prélèvements de nature variée.

En génétique, la PCR est une première étape pour l’étude d’une région génomique donnée. Elle permet de cibler cette région pour rechercher des polymorphismes associés à une maladie ou à une sensibilité particulière à certains agents infectieux ou certains médicaments.

Le principe de la PCR

Deux amorces (oligonucléotides d’environ 20 bases) spécifiques du fragment à rechercher et situées à chaque extrémité de la cible sont utilisées comme "têtes chercheuses".
Bien choisies, ces amorces sont incapables de s’hybrider de façon efficace ailleurs que sur le fragment ciblé, ce qui explique la spécificité de la PCR.
Une fois la cible trouvée, une enzyme thermostable (la Taq Polymérase) recopie de façon très fidèle de nouveaux fragments d’ADN similaires à ceux de la séquence originale présente dans le prélèvement.
Ces cycles d’hybridation des amorces et de polymérisation d’ADN sont répétés au moins 30 à 40 fois aboutissant à une multiplication exponentielle de la séquence cible originale.
Cette amplification explique la sensibilité des techniques PCR (ou plutôt leurs seuils de détection très bas : la présence de quelques copies de génome viral donne naissance en deux heures à plusieurs milliards de fragments identiques).

Vous pouvez également consulter notre animation présentant les techniques de PCR et de PCR en temps réel.

Les avantages de la méthode...

La PCR est un moyen très performant de diagnostic direct des maladies infectieuses ou parasitaires, notamment dans les phases précoces de l’infection ou lorsque la vaccination ou la présence d’anticorps maternels sont susceptibles d’interférer avec le diagnostic sérologique (diagnostic indirect).
La rapidité des résultats (chez Scanelis, J+1 à J+2) peut s’avérer un avantage décisif notamment si la maladie suspectée est une zoonose (leptospirose) ou si la mise en oeuvre rapide de mesures sanitaires s’impose dans un élevage (maladie de Carré, Parvovirose).
L’expédition des prélèvements ne nécessite pas de précautions particulières et il est possible de rechercher simultanément plusieurs agents pathogènes dans un même échantillon.

Et ses limites...

Les limites de la PCR tiennent aux difficultés de conception, de mise en oeuvre et d’interprétation des tests.
En conception, il ne suffit pas de choisir deux amorces spécifiques pour développer un test PCR pertinent. De très nombreux facteurs influencent les performances réelles de la technique comme :

  • le choix du prélèvement (qui doit contenir l’agent infectieux),
  • les techniques de traitement des échantillons avant la PCR (adaptées à chaque type de prélèvement),
  • l’optimisation et la validation de la méthode (choix des réactifs, du matériel et des conditions de réactions, inclusion de témoins adaptés : le seuil de détection est-il vérifié sur chaque série ?).

Le choix de la technologie est décisif. Par exemple il est illusoire d’espérer diagnostiquer une maladie de Carré sur un chiot récemment vacciné ou de la PIF sur un chat si l’on utilise pas de PCR quantitative (PCR en temps réel).

Lors de la mise en oeuvre, un certain nombre d’écueils sont à éviter (contamination des prélèvements au laboratoire, présence d’inhibiteurs ...). Il convient donc de s’adresser à un laboratoire spécialisé et expérimenté dans ces technologies.
De plus l’intérêt du résultat obtenu est étroitement lié à la qualité et au choix des prélèvements : modalités de prélèvements adaptées à la pathologie, choix du prélèvement en fonction de l’évolution clinique, richesse des prélèvements en cellules pour les écouvillons, cytobrosses, ...
Pour l’interprétation des résultats, il est également nécessaire de connaître le pourcentage d’animaux asymptomatiques avec le test utilisé.